Ze słuchem powiązanych jest ok. 200 genów. Mamy coraz większe możliwości ich badania, bo w ostatnich latach w laboratoriach genetycznych nastąpił technologiczny przełom. O nowoczesnych technologiach, które rewolucjonizują badania genetyczne, rozmawiamy z dr hab. Moniką Ołdak, prof. IFPS, kierownikiem Zakładu Genetyki Instytut Fizjologii i Patologii Słuchu.
Obecnie w laboratoriach genetycznych stosowane są nowoczesne technologie sekwencjonowania genów. Jakie znaczenie mają one w badaniach nad genami odpowiedzialnymi za niedosłuch?
Ogromne. Dzięki nowym metodom sekwencjonowania DNA możliwe jest badanie ogromnej liczby genów, a nawet całych genomów. W krótkim czasie! Tylko połowa zaburzeń słuchu genetycznie uwarunkowanych jest efektem mutacji w genie GJB2 kodującym koneksynę 26. W pozostałych przypadkach za niedosłuch odpowiada wiele innych genów. Kiedy do Poradni Genetycznej Instytutu trafia pacjent z niedosłuchem, sprawdzamy najpierw, czy ma on mutację w genie GJB2. Jeśli testy jej nie wykryją, musimy podjąć decyzję, które z genów badać w dalszej kolejności. To trudny wybór. Teraz dzięki nowym technologiom możemy prowadzić dalsze poszukiwania. Typujemy wiele genów, które w formie zmutowanej mogą odpowiadać za niedosłuch, i badamy je wszystkie jednocześnie. A jeśli i tym razem nie natrafimy na zmiany, możemy zbadać cały eksom, czyli część DNA kodującą białka. Robimy to jednak tylko w ramach badań naukowych. W diagnostyce ta metoda na razie nie znajduje szerokiego zastosowania, bo wysokoprzepustowe technologie, które w krótkim czasie pozwalają przebadać ogromne obszary genomu, są nadal kosztowne. Chociaż – gdy uwzględnimy, jak dużo informacji uzyskujemy, nie wydają się one już takie drogie. Komercyjne badanie całego eksomu to koszt ok. 9 tysięcy zł. Jeśli tę kwotę podzielimy na ok. 20–25 tysięcy genów kodujących białka, to koszt badania jednego okazuje się naprawdę niski.
Ale jak sprawdzić, czy zmiana wykryta dzięki nowym technologiom ma związek z konkretnym zaburzeniem czy chorobą?
Opracowano schematy postępowania, które to umożliwiają. Wprawdzie nie są one idealne, ale przecież niedawno mieliśmy jeszcze mniej narzędzi pozwalających na zbadanie związku między mutacją a zaburzeniem czy chorobą.
Nowe zmiany w genach prościej jest wykryć w rodzinach obciążonych jakimś schorzeniem. W celu sprawdzenia nowo odkrytego powiązania genetycznego, badaniom genetycznym poddaje się wszystkich – zarówno zdrowych, jak i chorych członków rodziny. Jeśli mutacja występuje tylko u chorych, przyjmuje się, że jest ona przyczyną choroby. Wątpliwości pojawiają się w chwili, gdy u któregoś z chorych członków takiej rodziny nie wykrywa się zmiany albo gdy stwierdza się ją u osoby zdrowej. Chorego bez mutacji można jednak uznać za przypadek tzw. fenokopii (cecha organizmu powstała pod wpływem warunków środowiska, identyczna z cechą uwarunkowaną obecnością określonego genu, niedziedziczna). Obecność mutacji w genie zdrowego członka rodziny tłumaczyć można natomiast niepełną penetracją – zakłada się, że mimo defektu genetycznego organizm w jakiś sposób broni się przed chorobą. Wyniki badań w niektórych przypadkach potwierdzają, że taka argumentacja jest słuszna. Na przykład w neuropatii wzrokowej często uszkodzony jest gen kodujący białko OPA1, ważny dla przemian, jakie zachodzą w komórkowych elektrowniach, którymi są mitochondria. Niektórzy pacjenci z mutacją w genie OPA1 nie mają jednak kłopotów ze wzrokiem, bo organizm kompensuje sobie uszkodzenie tego białka obecnością innych aktywnych kompleksów białkowych, które zapobiegają deficytom energetycznym.
Teraz – dowodząc związku między wykrytą zmianą a chorobą – możemy wykorzystać coraz więcej narzędzi badawczych. Jaki jest wpływ mutacji na organizm, daje się prześledzić na poziomie molekularnym. W laboratorium można sprawdzić, jak warianty genów zmieniają funkcję białek i całego organizmu. Przypomnijmy – na podstawie zapisu genetycznego w DNA powstaje RNA, a na podstawie RNA – białko zbudowane z aminokwasów, takich pojedynczych cegiełek. Sprawdzamy zatem, w jaki sposób zmiana w genie wpływa na transkrypcję, czyli przepisywanie informacji genetycznej z DNA na RNA, czy ilość i struktura RNA nie ulegają zmianie. Dalej, czy na podstawie RNA powstaje białko, jaka jest jego ilość, czy zmianie nie ulega jego struktura, wreszcie czy reakcje, w jakie wchodzi produkt uszkodzonego genu z innymi białkami, są zmienione, a jeśli tak, to na ile zaburza to fizjologię komórek. Ogólnie mówiąc, próbujemy zrozumieć konsekwencje zmian widocznych w DNA, poznać te konsekwencje na poziomie białka, komórki czy całego organizmu, zrozumieć funkcjonalne efekty mutacji. Ten kierunek badań to tzw. genetyka funkcjonalna.
Badania z tego zakresu wykonuje się na hodowlach komórkowych?
Tak, chociaż możliwości wykonywania badań funkcjonalnych są jeszcze ograniczone ze względu na koszty, złożoność takiego przedsięwzięcia, ale również z uwagi na małą dostępność niektórych tkanek. Obecnie nie ma na przykład dostępnych komercyjnie komórek wyhodowanych ze ślimaka, które byłyby idealne do badań nad zmianami genetycznymi powodującymi niedosłuch. Dlatego do genetycznych badań funkcjonalnych używa się na razie innych komórek, np. krwi, nabłonka, fibroblastów. Prowadzi się je też na modelach zwierzęcych, najczęściej na myszach, danio pręgowanym czy muszkach owocowych. My wykonujemy takie badania we współpracy z Warszawskim Uniwersytetem Medycznym. Śledzimy na przykład zmiany powodowane przez wykrytą przez nas w jednej z rodzin nową mutację genu odpowiadającego za produkcję białka wolframiny. Mutacja występująca w jednej kopii genu wolframiny prowadzi do niedosłuchu izolowanego, a w dwóch kopiach tego genu – powoduje tzw. zespół Wolframa (niedosłuch, moczówka prosta, zanik nerwu wzrokowego i cukrzyca). Istotne, że przy dotychczas opisywanych mutacjach niedosłuch ogranicza się zwykle do niskich częstotliwości. W przypadku członków dużej, wielopokoleniowej rodziny, w której wykryliśmy nową mutację genu wolframiny, ten niedosłuch nie jest taki charakterystyczny.
W genetyce od dawna wiadomo, że różne zmiany w tym samym genie mogą prowadzić do różnych fenotypów. Dlatego trafiając na nową mutację w genie wolframiny, nie mogliśmy zakładać, że jest ona patogenna. Będziemy to sprawdzać za pomocą metod genetyki funkcjonalnej. Badania prowadzimy na hodowlach komórek nabłonkowych. Wprowadzamy do nich nieprawidłową kopię genu wolframiny i obserwujemy, jaki ma to wpływ na procesy zachodzące w tych komórkach, porównując je jednocześnie z komórkami, do których wprowadziliśmy prawidłowy gen. To trudne zadanie, zwłaszcza jeśli weźmiemy pod uwagę, że mechanizm powstawania niedosłuchu u osób z wcześniej wykrytą mutacją w genie wolframiny nie jest dokładnie poznany. Nieprawidłowa struktura białka kodowanego przez ten gen może indukować stres siateczki śródplazmatycznej, zaburzać fałdowanie białek, prowadzić do apoptozy, czyli samobójczej śmierci komórki. Równie dobrze jednak uszkodzony gen może działać w innym mechanizmie, np. zaburzając interakcje z innymi białkami. Wciąż nie wiadomo, dlaczego mutacja w jednej kopii powoduje niedosłuch, a w dwóch – ciężką chorobę całego organizmu, jaką jest zespół Wolframa. Liczymy na to, że badania z zakresu genetyki funkcjonalnej pomogą nam odpowiedzieć na te pytania.
Dociekanie, czy mutacja ma związek z chorobą, na hodowlach komórkowych wymaga wiele wysiłku i czasu. Czy można sprawdzić to prościej, szybciej?
Tak, przy użyciu algorytmów bioinformatycznych. Istnieją programy komputerowe, w których uwzględnia się właściwości fizykochemiczne aminokwasów. Przewidują, jak mutacja, która sprowadza się do zamiany pojedynczego aminokwasu w białku, wpłynie na jego trójwymiarową strukturę i czy może być to szkodliwe dla organizmu. Takich programów jest wiele. My zastosowaliśmy dwa najczęściej używane. Obydwa wskazywały na to, że nowo wykryta zmiana w genie wolframiny jest patogenna. Właśnie ten wynik przemawiał za tym, aby zaprojektować badania funkcjonalne. Na programach bioinformatycznych nie można polegać bowiem w stu procentach, one szacują tylko prawdopodobieństwo patogenności mutacji. Uzyskiwane dzięki nim wyniki bywają sprzeczne – z jednego programu wynika, że określona zamiana aminokwasów w białku jest szkodliwa, a z innego, że nie.
A czy częstość występowania mutacji w populacji ma znaczenie?
Tak. Określenie częstości występowania mutacji w populacji to ważny etap w badaniu nowych zmian genetycznych oraz w badaniu związku zmian genetycznych z określonymi chorobami. W przypadku chorób monogenowych tryb postępowania jest następujący: analizujemy segregację mutacji z chorobą w badanej rodzinie, sprawdzamy, gdzie zmiana lokalizuje się w białku (w przypadku wolframiny jest to koniec karboksylowy łańcucha białkowego), jakie są wyniki analiz bioinformatycznych, a następnie sprawdzamy, jak często ta zmiana występuje w populacji ogólnej. W genetyce przyjęliśmy założenie statystyczne, że dla chorób dziedziczonych recesywnie częstość mutacji w populacji ogólnej powinna wynosić poniżej 1 proc., a dla chorób, u podłoża których leżą zmiany w genach dziedziczonych jako cechy dominujące, -0,1 proc. Jeśli zatem – w tym pierwszym przypadku – zmiana genetyczna występuje w populacji z częstością powyżej 1 proc., a w tym drugim z częstością powyżej 0,1 proc., to jej patogenność jest wątpliwa. To ramy, których staramy się trzymać w genetyce. Wiadomo jednak, że najczęstsze choroby uwarunkowane genetycznie mogą przekroczyć wyznaczone granice. Na przykład mutacja 35delG w genie GJB2, która najczęściej powoduje niedosłuch, występuje w populacji polskiej z częstością 2,5–3 proc. Podobnie jest w przypadku mukowiscydozy (nosicielem mutacji odpowiedzialnej za tę chorobę jest 1 na 25 osób). W przypadku rzadkich chorób recesywnych nosicielstwo trzyma się przeważnie wspomnianych ram.
Dzięki nowym technologiom badań genetycznych, dających możliwość sprawdzania całych eksomów, wiemy, że niektóre zmiany wcześniej opisywane jako mutacje (zmiany patogenne) tak samo często występują zarówno u osób chorych, jak i zdrowych. Takie zmiany nie są patogenne. Natomiast geny, które opisywano jako przyczynę choroby, wcale jej nie powodują.
Znamy takie przypadki, w których doszło do obalenia utartych poglądów?
Tak. Nasz Zakład Genetyki ma nawet zasługi na tym polu. Dowiedliśmy, że mutacja w genie RAB40AL (koduje białko biorące udział w transporcie pęcherzyków między organellami komórkowymi) na chromosomie X była do tej pory mylnie opisywana w literaturze naukowej jako przyczyna zespołu Martin-Probsta (MPS). Zespół ten objawia się głównie niedosłuchem, niesprawnością intelektualną, pewnymi cechami dysmorfii. Został opisany kilkanaście lat temu u trzech mężczyzn z jednej rodziny przez parę amerykańskich genetyków: Donnę M. Martin i Franka J. Probsta. Oni też, dzięki nowym technikom sekwencjonowania, odnaleźli region na chromosomie X, w którym ci trzej pacjenci mieli identyczną zmianę. Analiza bioinformatyczna wskazywała, że jest to zmiana patogenna. A w genetycznej bazie zawierającej opis kilku tysięcy genomów nie znaleźli ani jednej osoby, która miałaby taką zmianę. Martin i Probst zrobili nawet eksperymenty z zakresu genetyki funkcjonalnej – wynikało z nich, że białko RAB40AL wytworzone na podstawie zmienionego zapisu genetycznego miało nieprawidłową lokalizację wewnątrz komórek. Dwa lata temu opublikowali więc pracę, w której ogłosili, iż podłożem fenotypowo opisanego kilkanaście lat wcześniej zespołu jest mutacja genu RAB40AL.
My wykryliśmy tę mutację u pacjenta z neuropatią wzrokową. Nie dopatrzyliśmy się jednak u niego żadnych objawów zespołu MPS. Pacjent dobrze słyszał i nie miał żadnych cech upośledzenia intelektualnego. Potem natrafialiśmy na kolejny przypadek. Zmianę, która miała odpowiadać za zespół występujący u mężczyzn, wykryliśmy na przykład u pacjentki z niedosłuchem. Jeden z jej braci, który także okazał się nosicielem tej mutacji, był całkowicie zdrowy. Pacjentów ze zmutowanym genem RAB40AL, ale bez objawów zespołu MPS znaleźliśmy zresztą więcej. Zaczęliśmy więc badać, jak często ta zmiana występuje w polskiej populacji. Okazało się, że posiada ją aż 2 proc. z nas! Dodatkowo przeprowadziliśmy badania genetyczne w grupie mężczyzn z wyższym wykształceniem. Prawie 3 proc. z nich posiada tę mutację. Zaintrygowani wynikami naszych badań zaczęliśmy przeszukiwać bazy danych, które zawierają informacje o sekwencji DNA 6500 osób. Znaleźliśmy w nich zaledwie dwóch nosicieli mutacji w genie RAB40AL. To ilustruje odrębność genetyczną populacji polskiej. Prowadząc badania przy użyciu nowych technologii, odkrywamy zmiany, które jeszcze nigdzie nie były opisywane. Już wcześniej natrafiałam na takie mutacje, prowadząc badania nad dziedzicznymi chorobami narządu wzroku.
Może mutacja w genie RAB40AL tylko w polskiej populacji nie wywołuje choroby, a w innych prowadzi do powstania zespołu Martin-Probsta?
W świetle naszych badań mutacja ta jest po prostu przypadkowym znaleziskiem. Na to wskazują także genetycy z Niemiec, zajmujący się badaniami przyczyn niesprawności intelektualnej. My szukaliśmy mutacji wśród zdrowych, a niemiecki zespół – wśród pacjentów z objawami niepełnosprawności intelektualnej. Na ponad 400 przebadanych osób mutację miały cztery. Przy czym w ich rodzinach nie stwierdzono segregacji tej zmiany genetycznej z niepełnosprawnością intelektualną. Podsumowując nasze badania, napisaliśmy artykuły do „Human Mutation” a następnie „European Journal of Pediatrics”. Jego recenzenci zastanawiali się, co – jeśli niewskazana wcześniej mutacja – może być przyczyną zespołu Martin-Probsta. Zwrócili uwagę na to, że gen RAB40AL ma wiele wariantów. Możliwe, że właśnie jakiś rzadki wariant genetyczny przyczynia się do powstawania choroby. Jaka jest genetyczna przyczyna zespołu Martin-Probsta na razie nie wiadomo.
A zatem para amerykańskich naukowców zbyt wcześnie wyciągnęła wnioski?
Na to wygląda. Warto jednak podkreślić, że przeprowadzili oni badania z należytą rzetelnością, przestrzegając wszystkich procedur. Badania rodziny, analizy bioinformatyczne, a nawet eksperymenty z zakresu genetyki funkcjonalnej wskazywały na to, że mutacja w genie RAB40AL jest przyczyną choroby. My, będąc na ich miejscu, wyciągnęlibyśmy takie same wnioski.
Problem polega na tym, że podobne doniesienia przekładają się na diagnostykę. Kiedy u pacjenta znajduje się mutację opisywaną jako zmiana odpowiadająca za powstawanie zespołu Martin-Probsta, może to prowadzić do pomyłki diagnostycznej i przedwczesnego rozpoznania choroby głównie na podstawie wyniku badania DNA. My nie zrobiliśmy tego u mężczyzny z neuropatią wzrokową, gdyż u naszego pacjenta nie występował żaden z objawów opisywanych dla tego zespołu. Ostatnio jednak jeden z ośrodków opisał pacjenta, który ma mutację w genie RAB40AL oraz cztery z dziewięciu cech typowych dla zespołu Martin-Probsta. Czy to wystarczy, aby postawić taką diagnozę? W przypadku rzadkich, słabo opisanych chorób genetycznych postawienie właściwej diagnozy jest bardzo trudne.
Jak często genetycy – prowadząc badania z zastosowaniem nowych technologii – natrafiają na podobne niespodzianki?
Na razie z grupy genów łączonych z niedosłuchem wyeliminowano jeszcze jeden – MYO1A. Po raz pierwszy powiązano go z niedosłuchem dominującym w 2003 roku. Przed kilkoma miesiącami opublikowano dane, z których wynika, że nie jest on odpowiedzialny za zaburzenia słuchu. Wciąż odkrywane są jednak nowe, nieznane dotąd mutacje, ale również nowe geny powiązane z niedosłuchem. Z roku na rok, dzięki doskonalszym i łatwiej dostępnym technologiom wykrywa się ich coraz więcej. •
Rozmawiała: Jolanta Chyłkiewicz
Przełom technologiczny w badaniach DNA
Najczęstsze geny powodujące niedosłuch
Za niedosłuch najczęściej odpowiadają mutacje w genie GJB 2, który koduje koneksynę 26, czyli białko uczestniczące w tworzeniu połączeń międzykomórkowych, odpowiedzialnych za transport jonów w komórkach ślimaka niezbędny dla prawidłowego słyszenia. Najczęstszą z nich jest mutacja 35delG. Niedosłuch mogą też powodować zmiany w genie GJB6 sąsiadującym z genem GJB2. Mutacje w tych genach powodują niedosłuch izolowany, czyli niepowiązany z innymi wadami. Dziedziczy się go recesywnie. Oznacza to, że ujawnia się on dopiero wtedy, gdy pacjent ma dwie kopie zmutowanego genu – jedną odziedziczoną po ojcu i jedną po matce. Osoby posiadające tylko jedną kopię słyszą normalnie. Jeśli np. dziecko ma niedosłuch dziedziczony recesywnie, to szansa, że przyczyną są mutacje właśnie w tych dwóch genach, wynosi ok. 60 procent.
Obecnie stosowane technologie pozwalają na określenie sekwencji całego genomu w jeden dzień. Przez ponad 30 lat w badaniach genetycznych stosowano technologię sekwencjonowania DNA metodą Sangera. Z jej użyciem w 2001 r. zakończono projekt sekwencjonowania ludzkiego genomu. Od tego momentu rozpoczęły się poszukiwania nowych technologii, które w szybki i tani sposób pozwalają na odczytywanie DNA zarówno dla diagnostyki klinicznej, jak i naukowych badań genetycznych. Te zalety ma opracowane w ciągu ostatnich pięciu lat sekwencjonowanie nowej generacji (ang. next-generation sequencing, NGS). Stara technologia pozwalała na odczyt sekwencji z wydajnością 120 000 par zasad na dobę. Szacunkowy koszt odczytu 1 mln par zasad wynosił 12 000 PLN. Sekwencjonowanie pojedynczego ludzkiego genomu o wielkości 3,2 mld par zasad zajęłoby 73 lata, a koszt byłby kolosalny. Nowoczesne technologie pozwalają na sekwencjonowanie ludzkiego genomu w bardzo krótkim czasie za ułamek kosztów ponoszonych wcześniej. Technologie te umożliwiają nie tylko odczytanie pełnej sekwencji genomu, lecz także analizy na mniejszą skalę, m.in. sekwencjonowanie eksomu (część genów kodujących białka, stanowiąca 1 proc. genomu), oraz wychwytywanie zestawu konkretnych genów (ograniczenie analizy do badania tylko znanych genów, których mutacje są przyczyną konkretnego schorzenia). Analiza eksomu jest bardziej kosztowna niż nakierowana na małą ilość genów, ale umożliwia zarówno poszukiwanie zmian patogennych w znanych genach, jak i odkrywanie nowych genów powiązanych z konkretnym zaburzeniem czy chorobą. W przypadku tej metody nie są analizowane sekwencje niekodujące białek, które mogą zawierać elementy regulatorowe istotne dla prawidłowego funkcjonowania genów. Mimo to technologia ta jest uważana za skuteczną w wykrywaniu nowych genów, ponieważ większość zmian patogennych (ok. 85%) spowodowana jest mutacjami w regionach kodujących. Z użyciem tej technologii odkryto w ostatnich latach nowe geny powiązane z niedosłuchem.